일회용(Single-use) 장비를 활용한 세포 기반의 인플루엔자 바이러스 백신 생산 공정

이 기사는 백신 제조 분야에서 GE Healthcare Life Sciences의 일회용(Single-use) 제품을 어떻게 활용할 수 있는지를 입증하는 데 그 목적이 있습니다. 이 기사에서는 현대 백신 제조 공정에 대해 간략히 논의하는 한편, 일회용(Single-use) ReadyToProcess 기술을 사용해 세포 기반의 약독 생균 인플루엔자 바이러스를 생산하기 위한 업스트림 및 다운스트림 공정의 스케일업을 보여주는 사례 연구를 소개합니다(그림 1).

그림 1. ReadyToProcess 일회용(Single-use) 장비는 세포 기반의 바이오의약품 생체 백신 제조에 맞는 편리한 솔루션을 제공합니다.

소개

난자 기반 생산은 인플루엔자 백신 제조 시 가장 흔히 사용되는 기술입니다. 이 기술은 백신 1회분 생산량당 수정란이 1개씩 필요하다는 한계가 있습니다. 인플루엔자 백신에 대한 WHO 글로벌 행동 계획(GAP) 목표는 2015년까지 20억 명의 인구를 대상으로 예방 접종을 위한 계절 독감 백신을 충분히 생산하는 데 있습니다(1). 유행성 독감이 발생할 경우, 무방비로 노출된 인구를 2회의 예방 접종으로 보호하기 위해서는 전 세계적으로 130억 회 이상의 투여량이 필요합니다. 상황을 살펴보면 2011년에는 세계 유수의 백신 제조업체 중 25개 업체에서 6억 2천만 회 분량의 백신을 생산했습니다(2). 더 짧은 기간 내에 더 많은 양의 백신을 생산해야 하는 요구가 분명히 있습니다.

잘 특성화된 공정을 통한 세포 기반 백신 생산은 생산 능력 요건을 충족시키는 솔루션이 될 수 있습니다. 또한 이러한 생산 방식은 난자 기반 생산보다 생산 시간이 비교적 짧기 때문에 계절성 균주에 대해 보다 신속하게 대응할 수 있는 능력을 향상시킬 수 있는 여지가 있습니다.

시판 중인 독감 백신은 크게 3가지 유형 즉, 분할 바이러스, 소단위 백신 및 약독 생균 바이러스로 구분됩니다. 약독 생균 인플루엔자 백신(LAIV)은 백신 1회분 투여량당 바이러스 입자 요구량이 적습니다. 다시 말하면, 단위 생산량당 1회분 투여량이 더 많기 때문에 생산 능력의 부족을 어느 정도 보완할 수 있습니다.

오늘날 서구의 예방 접종 프로그램에서 그 기초가 된다고 간주되는 백신들 중 일부는 생산 비용, 물류, 생산 능력 등 극복해야 할 장벽이 많은 이유로 아직까지 개발도상국에 이르지 못한 실정입니다. B형 인플루엔자균(Haemophilus influenza B, 약칭 HiB), 일본 뇌염 (JE), 로타바이러스, 폐렴구균 감염 등의 질병들은 개발도상국에서 수백만 명에 달하는 어린이들의 생명을 구하기 위해 퇴치해야 할 표적이 되고 있습니다. 따라서 개발도상의 시장에 대한 접근성을 높이고 백신 요구에 보다 신속하게 대응하며 1회분 투여량의 생산량을 늘리기 위해서는 기존의 백신 제조 공정을 계속 발전시킬 필요가 있습니다. 미래의 백신은 일련의 새로운 기술로 개발해야 합니다. 현대식 공법과 세포 기반의 업스트림 공정을 활용하면 유통 장벽을 극복하고 생산 비용과 시설 점유 면적을 줄이기 위해 현지 시장에 더 가까운 곳에서 제품을 생산할 수 있습니다.

향상된 제조 민첩성 및 생산성

일회용 기술(Single-use Technology)에 기반한 바이오의약품 제조는 기존 스테인리스 시스템 제조 설비보다 뛰어난 유연성을 제공합니다. 생산 라인은 다양한 제품들을 제조할 수 있도록 더 쉽게 개조할 수 있으며, 시장 요구를 충족하기 위해 생산량을 훨씬 더 쉽게 조정할 수 있습니다. 또한 일회용(Single-use) 제품은 생산 배치 간에 교차 오염이 발생할 위험을 최소화하며, 시간과 비용이 많이 드는 세척 및 검증 절차를 진행할 필요가 없습니다.

일회용(Single-use) 시스템은 오늘날 제조업계에서 널리 수용되고 있으며, 자본 투자 비용 감소 및 투자 유예는 물론, 고정 비용에서 변동 비용으로의 전환과 같은 이점들 덕분에 광범위하게 활용되고 있습니다. 일회용(Single-use) 시스템을 사용하면 매년 더 많은 배치를 생산할 기회를 확보함으로써 캠페인 간에 신속한 전환을 할 수 있습니다. 설비 활용의 최적화는 생산 비용을 최소화하고 잠재적으로 수익을 늘리기 위한 열쇠입니다.

환경 영향 감소

바이오의약품 제조 공정에서 일회용(Single-use) 제품의 구현이 환경에 미치는 영향은 폭넓게 논의되어 왔습니다. 일회용(Single-use) 제품에 대한 환경 영향이 기존 스테인리스 시스템 제조 설비보다 더 크다는 인식이 있습니다. GE Healthcare Life Sciences가 Biopharm Services와 공동으로 진행한 동료 심사 라이프 사이클 평가(LCA) 연구에서는 일회용(Single-use) 장비를 기존 스테인리스 시스템 장비와 비교했습니다(3). 환경 영향에 대한 평가는 장비의 구성 재료 및 구성품의 생산부터 장비의 사용 및 최종 폐기에 이르기까지 제품의 전체 수명 주기에 걸쳐 진행했습니다. 이 연구를 실시한 결과, 일회용(Single-use) 장비를 기반으로 한 설비는 기존 스테인리스 시스템 장비를 기반으로 하는 설비보다 환경 영향이 적은 것으로 나타났습니다. 이러한 연구 결과는 조사 대상에 포함된 18가지 환경 영향 범주에서 모두 나타났습니다. LCA 연구에 따르면 사용 단계에서 에너지 수요 및 물 요구량의 절감 효과가 가장 큰 것으로 확인되었습니다.

일회용(Single-use) 장비를 이용한 인플루엔자 바이러스 생산

오늘날 백신 제조 분야의 과제들을 해결하기 위해 일회용(Single-use) 장비만을 기반으로 한 백신 생산 스케일업 사례 연구가 진행되었습니다. 이 연구에서는 전체 생균 인플루엔자 바이러스를 모델 시스템으로 사용했습니다. 이 기사에서는 실험실 수준에서 생산 규모 확장(스케일업)에 관한 요약 정보를 제공합니다. 개별 업스트림 및 다운스트림 공정에 대한 자세한 설명은 별도의 어플리케이션 노트 29043548(4) 및 29043549(5)에서 제시하고 있습니다.

그림 2는 세포 확장, 인플루엔자 전파, 정제 및 분석을 포함한 업스트림 및 다운스트림 공정에 대해 간략히 설명합니다.

그림 2. ReadyToProcess 장비를 이용한 전체 생균 인플루엔자 바이러스의 생산 공정에 대한 개요.

업스트림 공정

부착성 베로(Vero) 세포를 정지 세포 공장에서 확장한 결과, 10L 종배양물에 대한 접종물이 생성되었습니다. 10L 배양물 내 세포들은 WAVE 바이오리액터 20/50 시스템 내 Cytodex 1 Microcarriers(3g/L)에서 배양되었습니다. 이들 세포는 1mL당 약 3×106개의 세포 농도로 배양되었습니다. 그런 다음, 트립신을 이용해 Microcarriers로부터 세포들을 분리한 후, 이들 세포를 사용해 WAVE 바이오리액터 200 시스템에서 50L Microcarriers 배양물을 접종했습니다. Microcarriers 농도는 항상 일정하게 유지했습니다. 작업 용량을 10L에서 50L로 스케일업하는 동안 1:5의 분할비에 대해 충분한 양의 세포 회수가 이루어졌습니다.

세포 전이에서 공통적인 문제점은 세포들이 새로운 배양액에 적응하며 세포 수의 증가가 거의 또는 전혀 관찰되지 않는 지연 단계입니다. 50L 배양에서 세포들은 다시 부착되었고 지연 단계 없이 새로운 Microcarriers에서 증식하기 시작했습니다. 세포 증식률은 3개의 연속 배치에 포함된 10L 및 50L 배양물에서 모두 유사한 것으로 나타났습니다(그림 3).

그림 3. (A) 10L 종배양물 및 50L 스케일업 배양물에서 세포 증식 및 (B) 평균 세포 증식률. 오차 막대는 하나의 표준 편차를 나타냅니다.

50L 배양물에서 세포들은 1mL당 약 2×106개의 세포 밀도로 증식되었습니다. 세포들은 4 × 10-3의 감염 다중도 및 2mg/L의 트립신 농도에서 지수 증식 단계 중 인플루엔자 바이러스 균주인 A/H1N1/Solomon Island에 감염되었습니다. 감염 단계에서 매일 샘플을 채취했습니다. 그림 4에서 보는 바와 같이, 바이러스 입자의 전염량과 총량은 초기에 빠르게 증가하다가 바이러스 입자의 양이 1mL당 약 109개로 측정된 수확 시점까지 항상 일정한 수준으로 유지되었습니다.

혈구응집소(HA) 농도는 감염 단계의 시작부터 끝까지 계속 증가하였으며 수확 시 약 12μg/mL로 측정되었습니다. 10L 배양물에서 바이러스 역가와 HA 농도는 50L 배양물의 그것과 비슷한 수준(데이터는 표시되지 않음)으로 측정되었습니다(그림 4).

세포 배양 및 바이러스 감염과 수확에 대한 자세한 설명은 어플리케이션 노트 29043548 (4)에 제시되어 있습니다.

그림 4. 바이러스 입자(vp)의 총량 및 감염량. 감염 후 24시간, 48시간, 72시간 및 96시간이 경과한 시점에 각각 샘플을 채취했습니다.

다운스트림 공정 및 순도 분석

일회용이 아닌 표준 장비를 사용하여 실험실 규모의 다운스트림 정제를 진행하기 위해 업스트림 공정에서 약 10L의 바이러스 수확물을 사용했습니다. 50L의 배양물에서 얻은 약 44L의 바이러스 수확물(나머지 6L의 배양물은 Microcarriers의 부피와 일치함)을 스케일업 정제 공정에서 ReadyToProcess 장비를 이용한 추가 다운스트림 공정에 활용했습니다.

숙주 세포에서 유래한 불순물은 다운스트림 공정에서 제거되었습니다. 세포 파편은 ULTA Prime GF 2μm 및 0.6μm 정상 흐름 필터를 사용한 1차 미세 여과 단계에서 제거되었으며, 이어서 ReadyToProcess Capto Q 크로마토그래피 컬럼을 이용해 숙주 세포 DNA를 제거했습니다. 숙주 세포 단백질은 ReadyToProcess Capto Core 700 크로마토그래피 컬럼을 사용해 제거했습니다.

Capto Core 700 크로마토그래피 레진은 정제 공정(6)의 두 번째 크로마토그래피 단계에서 사용되었습니다. 이 크로마토그래피 레진은 분자량(Mr)이 약 700,000을 넘는 분자들이 비드의 코어에 진입하는 것을 방지하는 가교 결합 아가로오스의 불활성 외층을 갖고 있습니다. 비드 코어는 단백질, 펩티드 및 뉴클레오타이드 단편을 비롯한 광범위한 물질을 결합하는 옥틸아민 리간드를 포함합니다. 크기 배제 및 친화성 결합을 모두 사용하는 크로마토그래피 레진의 multimodal 기능은 두 가지 절차를 하나로 결합하여 필요한 정제 단계의 수를 줄입니다. 옥틸아민 리간드는 넓은 pH 범위, 높은 염도 및 다양한 버퍼 조성에서 불순물이 결합하는 특성이 있기 때문에 Capto Core 700 크로마토그래피 레진의 기능을 저하하지 않으면서 매우 다양한 조건에서 이 레진을 사용할 수 있습니다. 따라서 이전 정제 단계에서 채취한 샘플은 버퍼 조건을 사전에 조정할 필요 없이 Capto Core 700 컬럼에 직접 로드할 수 있습니다. GE LifeSciences의 연구에서는 이러한 이점들 덕분에 필요한 버퍼의 수를 줄일 수 있었습니다. Capto Q와 Capto Core 700 컬럼은 직렬로 연결할 수 있으며 이를 통해 시스템 활용도를 높이고 전체 공정 시간을 단축할 수 있습니다.

무균 여과 단계에 앞서 바이러스 입자들을 농축시킨 후 이 입자들을 ReadyToProcess 중공 섬유 카트리지(RTPUFP-500-C-9S)를 이용한 정용여과(diafiltration)를 통해 최종 버퍼로 옮겼습니다. 마지막으로 ULTA Pure HC 0.6μm/0.2μm 무균 필터를 이용한 여과를 통해 해당 용액을 멸균했습니다.

바이러스 함량은 Biacore 방법에 따른 HA 농도 측정을 통해 계산했습니다(7). 감염성 입자의 양은 50% 조직 배양 감염 선량(TCID50)을 평가하여 분석했습니다. 바이러스 입자의 총량은 바이러스 수(Virus Counter 2100, ViroCyt, Denver, CO, USA)에 의해 계산되었습니다. 순도는 숙주 세포 DNA(정량적 PCR), 숙주 세포 단백질(Biacore 방법) 및 총 단백질(Bradford 방법)을 각각 측정하여 계산했습니다.

TCID50, HA 수율, 숙주 세포 게놈 DNA:HA 비 및 총 단백:HA 비로 환산한 결과들은 그림 5에서 보는 바와 같습니다. 바이러스의 전염성은 TCID50 역가를 통해 확인한 바와 같이 공정 전반에 걸쳐 그대로 유지되었습니다. 다운스트림 정제 공정, 바이러스 수 및 순도 분석에 대한 자세한 설명은 어플리케이션 노트 29043549(5)를 참조하시기 바랍니다.

그림 5. 인플루엔자 정제 공정에서 얻은 결과의 요약. 파란색으로 표시된 값들은 ReadyToProcess 장비를 사용하여 스케일업 생산 공정에서 파생된 데이터이며, 회색으로 표시된 값들은 실험실 규모의 생산 공정에서 파생된 데이터입니다. 스케일업 생산 공정에서 다운스트림 정제를 위한 전체 공정 시간은 3일이 소요되었으며 그 결과, 실험실 규모의 생산 공정에서 얻은 결과와 비슷한 수율 및 순도의 인플루엔자 바이러스가 생산되었습니다. 실험실 규모의 생산 공정에서 정화 후 게놈 DNA:HA 비는 미검출(n.d.)되었습니다.

규정 사양과의 비교

현재 시장에서는 승인된 세포 기반 LAIV가 없기 때문에 불순물에 대한 규제 요건이 마련되지 않은 실정입니다. 따라서 스케일업 생산 공정에서 얻은 생산량은 비강 LAIV에 대한 상용 사양 및 세계보건기구(WHO)의 난자 기반 분할-비활성화 인플루엔자 백신에 대한 사양과 비교됩니다(8). 연구 결과는 표 1에 요약되어 있습니다.

투여 경로는 비강이며 1회분 투여량 0.2mL당 107개의 감염성 입자들이 여러 번 투여된다고 가정할 때 스케일업 생산 공정에서 숙주 세포 DNA의 양은 WHO가 정의한 허용 수준(1회분 투여량당 10ng)보다 낮은 것으로 나타났습니다. 스케일업 생산에서 1회분 투여량 및 균주당 숙주 세포 단백질의 양 또한 WHO가 정의한 허용 수준보다 낮은 것으로 나타났습니다. 스케일업 생산 공정에서 얻은 결과를 살펴보면 비강 LAIV에 대한 사양에 따른 계산 시 수확량 1L당 약 3,000회의 투여량을 얻을 수 있는데 이는 1백만 회의 투여분에서 325L의 수확량을 얻는 셈이 되며, 분할-비활성화 백신에 대한 사양에 따른 계산 시 수확량 1L당 175회의 투여량을 얻을 수 있는데 이는 1백만 회의 투여분에서 5,760L의 수확량을 얻는 셈이 됩니다.

표 1. 1가 벌크에 대한 수확량 1리터당 투여량 스케일업 공정 요약

분할-비활성화 백신* 비강 LAIV†
수확량 1리터당 스케일업 생산량 175회 투여량, 매회 15μg HA 3,075회 투여량, 매회 107 TCID50 단위
106회 투여량을 생산하기 위한 수확물의 부피 5,760L 325L
단백질 불순물‡ 단백질 30μg/HA 15g 단백질 1.5μg/107 TCID50 단위
DNA 불순물§ 3.0ng/HA 15μg 0.15ng/7 TCID50 단위
* 분할-비활성화 백신은 3개의 균주를 포함하며, 이들 균주는 각각 15μg/HA입니다(예: 3 × 15 = 45μg HA/투여량, 각각 0.5mL).
† 비교는 비강 LAIV에 대한 상용 사양을 근거로 합니다. 0.2mL의 투여량은 107개의 형광 초점 단위(FFU)를 포함하고 있는데, 이는 TCID50 역가와 일치하는 것으로 추정됩니다.
‡ 단백질 불순물에 대한 WHO 지침: 균주 1개당 단백질 최대 100μg
§ DNA 불순물에 대한 WHO 지침: < 1회분 투여량당 DNA 10ng = HA 15μg당 DNA 3.3ng.

결론

이 기사에서는 ReadyToProcess 일회용(Single-use) 장비를 사용한 인플루엔자 백신의 스케일업 생산에 대해 설명합니다. 상당수의 백신 생산 공정들은 일회용(Single-use) 장비에 적합한 규모이며, 기존 스테인리스 시스템 장비를 사용하는 것보다 설비 활용을 최적화하기에 적합한 유연성과 가능성 향상에 따른 이점을 누릴 수 있습니다. 일회용(Single-use) 장비를 사용하면 제품 간 신속한 전환이 가능하고 배치 간에 교차 오염이 발생할 위험을 최소화할 수 있으며 세척 및 검증 작업의 필요성이 줄어듭니다. 이를 통해 매년 배치 수 및 다품종 제조량이 증가할 수 있으며 결과적으로 전반적인 공정 효율성이 향상됩니다.

본 사례 연구는 일회용(Single-use) 세포 배양 바이오리액터, 패킹된 크로마토그래피 컬럼 및 필터를 포함한 일회용(Single-use) 장비가 고순도의 백신 생산을 위해 스테인리스 시스템 바이오리액터, 사용자가 패킹한 크로마토그래피 컬럼, 초원심분리기 등의 기존 장비를 대체할 수 있음을 보여줍니다.

이 기사에 기술된 해당 사례 연구는 완전히 최적화된 공정은 아닙니다. 해당 공정은 백신 제조에 사용하기 전에 더 최적화해야 합니다.

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참고 문헌

  1. Global Action Plan for Influenza Vaccines (GAP). World Health Organization, Geneva. [online] www.who.int/influenza_vaccines_plan/en/ (2011).
  2. Partridgea, J. and Paule Kienyb, M. Global production capacity of seasonal influenza vaccine in 2011. Vaccine 3, 728-731(2013).
  3. Pietrzykowski, M., Flanagan, W., Pizzi, V., Brown, A., Sinclair, A., and Monge M. An Environmental Life Cycle Assessment Comparing Single-Use and Conventional Process Technology. BioProcess Int 24, 30-38 (2011).
  4. 어플리케이션 노트: Scale-up of adherent Vero cells grown on Cytodex microcarriers using single-use bioprocessing equipment, GE Healthcare, 29043548, Edition AB (2014).
  5. 어플리케이션 노트: Downstream scale-up purification of influenza virus using single-use bioprocessing equipment, GE Healthcare, 29043549, Edition AC (2014).
  6. 어플리케이션 노트: Purification of influenza A/H1N1 using Capto Core 700 GE Healthcare, 29000334, Edition AB (2012).
  7. Nilsson, C.E., Abbas, S., Bennemo, M., Larsson, A., Hämäläinen, M.D., and Frostell- Karlsson, A. A novel assay for influenza virus quantification using surface plasmon resonance. Vaccine 28, 759–766 (2010).
  8. Recommendations for the production and control of influenza vaccine (inactivated). World Health Organization Tech Rep Ser 927:103. (2005).